Cytoplazmatický dyneinový motorický protein

Obrázek 2. Aktivita mikrotubuly aktivované ATPázy CS-DN01 pomocí soupravy Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit (kat. č. BK053). ATPáza CS-DN01 byla testována ve dvou opakováních podle popsané metody. Kontrolní reakce bez mikrotubulů byly porovnány s reakcemi s mikrotubuly. 4 mM azid sodný inhibuje především aktivitu kinezinu, zatímco 30 µM vanadičnan sodný inhibuje dynein.

1. Postupujte podle protokolu pro přípravu roztoku MT v koncentraci 2,0 mg/ml v pufru PEM plus postupně přidávaný taxol. 1 mg stačí pro 96 testů.

a) Resuspendujte 1 mg >99% čistého prasečího tubulinu (kat. č. T240) v 0,5 ml ledově studeného PEM + 10% glycerolu (přidání dalšího GTP není nutné).

b) Umístěte na 2 min při 37 °C.

c) Přidejte 1 µl 2 mM taxolu (konečná koncentrace = 4 µM), inkubujte další 2 min.

d) Přidejte 1 µl 2 mM taxolu (konc = 4+4 µM), inkubujte další 2 min.

e) Přidejte 3 µl 2 mM taxolu (konc = 4+4+12 µM), inkubujte další 2 min.

f) Umístěte na stůl (ne na led nebo při 4 °C) a taxolem stabilizované MT jsou nyní připraveny. Skladovatelnost je 3 dny, pokud nejsou kontaminovány brouky nebo jinými chemikáliemi.

Poznámka: Pro účely screeningu se MT vyrábějí a používají tentýž den, nepoužívejte je, pokud jsou starší než 6 h, protože v důsledku pokračující hydrolýzy se vytvoří fosfát. Tím se zvýší pozadí a sníží se poměr S/N.

2. Připravte sloučeniny 20x ve 100% roztoku DMSO.

Doporučuje se 10 µl zásobního roztoku o koncentraci 2 mM sloučeniny.

3. Připravte motorovou směs takto.

a) b) Připravte 10 ml pufru PM12 s 10 µM taxolu ve finále (50 µl 2 mM zásobního taxolu). Zkontrolujte, zda v reakčním pufru nevzniká sraženina, v případě přítomnosti sraženiny připravte nový roztok.

c) Rozmrazte 100 µg lahvičku DN01 umístěním do vodní lázně o pokojové teplotě, dokud se nerozpustí, poté ji umístěte na led.

d) Při pokojové teplotě (RT) v 20 ml polypropylenové lahvičce (ne skleněné) smíchejte v následujícím pořadí:

.