Figur 2. CS-DN01 mikrotubulus-aktiveret ATPase-aktivitet ved hjælp af Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit (kat. nr. BK053). CS-DN01 ATPase blev analyseret i to eksemplarer i henhold til den beskrevne metode. Kontrolreaktioner uden mikrotubuli blev sammenlignet med dem med mikrotubuli. 4 mM natriumazid hæmmer hovedsagelig kinesinaktiviteten, mens 30 µM natriumvanadat hæmmer dynein.
1. Følg protokollen for fremstilling af MT-opløsning på 2,0 mg/ml i PEM-buffer plus sekventielt tilsat taxol. 1 mg er nok til 96 assays.
a) Resuspender 1 mg >99% rent svinetubulin (kat. nr. T240) i 0,5 ml iskold PEM + 10% glycerol (tilsætning af ekstra GTP er ikke nødvendig).
b) Placer ved 37°C i 2 min.
c) Tilsæt 1 µl 2 mM taxol (endelig konc. = 4 µM), inkubér i yderligere 2 min.
d) Tilsæt 1 µl 2 mM taxol (endelig konk = 4+4 µM), inkubér i yderligere 2 min.
e) Tilsæt 3 µl 2 mM taxol (endelig konk = 4+4+12 µM), inkubér i yderligere 2 min.
f) Placer på bænken (ikke på is eller ved 4°C), og de taxol-stabiliserede MT’er er nu klar. Holdbarheden er 3 dage, hvis de ikke er forurenet med insekter eller andre kemikalier.
Bemærkning: Til screeningsformål fremstilles og anvendes MT’erne samme dag; de må ikke anvendes, hvis de er mere end 6 timer gamle, da fosfat vil ophobes på grund af fortsat hydrolyse. Dette vil føje til baggrunden og reducere S/N-forholdet.
2. Forbered forbindelser i 20X i 100 % DMSO-opløsning.
10 µl stamopløsning ved 2 mM forbindelse anbefales.
3. Forbered motorblanding som følger.
a) b) Forbered 10 ml PM12-buffer med 10 µM taxol slut (50 µl af 2 mM taxol-stam). Kontroller reaktionsbuffer for udfældning, lav en ny opløsning, hvis der er udfældning.
c) Optø 100 µg hætteglas med DN01 ved at placere det i et vandbad ved stuetemperatur, indtil det er smeltet, og læg det derefter på is.
d) Bland følgende i rækkefølge ved stuetemperatur (RT) i en 20 ml polypropylen-flaske (ikke glas):
| # assays | 384 | 192 | 96 | 30 | ||
| 12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl PM12 +10µM taxol ved RT. | ||
| 1600 | 800 | 400 | 100 | µl af 2,0 mg/ml MTs i PM12 plus 20uM taxol. | ||
| 30 | 15 | 7 | 1,8 | µl af 100 mM ATP. | ||
| 24 | 12 | 6 | 1,5 | 1,5 | µl af 2.5M natriumazid | |
| 400 | 200 | 100 | 25 | µl af DN01 1mg/ml. |