Figura 2. Actividad de ATPasa activada por microtúbulos de CS-DN01 utilizando el kit de ensayo de punto final de Kinesina ATPasa (Cat. # BK053). La ATPasa CS-DN01 se ensayó por duplicado según el método descrito. Las reacciones de control sin microtúbulos se compararon con las que tenían microtúbulos. La azida sódica 4 mM inhibe principalmente la actividad de la kinesina, mientras que el vanadato sódico 30 µM inhibe la dineína.
1. Siga el protocolo para preparar la solución de MT a 2,0 mg/ml en tampón PEM más taxol añadido secuencialmente. 1 mg es suficiente para 96 ensayos.
a) Resuspender 1 mg de >Tubulina porcina pura al 99% (Cat. # T240) en 0,5 ml de PEM helado + 10% de glicerol (no es necesario añadir GTP adicional).
b) Colocar a 37°C durante 2 min.
c) Añadir 1 µl de taxol 2 mM (conc. final = 4 µM), incubar durante otros 2 min.
d) Añadir 1 µl de taxol 2 mM (conc. final = 4+4 µM), incubar durante otros 2 min.
e) Añadir 3 µl de taxol 2 mM (conc. final = 4+4+12 µM), incubar durante otros 2 min.
f) Colocar en el banco (no en hielo ni a 4°C) y las MT estabilizadas con taxol ya están listas. La vida útil es de 3 días si no se contamina con bichos u otros productos químicos.
Nota: Para fines de cribado, las MT se hacen y se usan el mismo día, no las use si tienen más de 6 h de antigüedad porque el fosfato se acumulará debido a la hidrólisis continua. Esto se sumará al fondo y reducirá la relación S/N.
2. Prepare los compuestos a 20X en una solución de DMSO al 100%.
Se recomiendan 10 µl de solución madre a 2 mM de compuesto.
3. Prepare la mezcla del motor como se indica a continuación.
a) b) Prepare 10 ml de tampón PM12 con 10 µM de taxol final (50 µl de 2 mM de taxol madre). Compruebe el tampón de reacción para ver si hay precipitado, haga una nueva solución si hay precipitación.
c) Descongele el vial de 100 µg de DN01 colocándolo en un baño de agua a temperatura ambiente hasta que se derrita, luego colóquelo en hielo.
d) Mezclar lo siguiente en orden a temperatura ambiente (RT) en un vial de polipropileno de 20 ml (no de vidrio):
Número de ensayos | 384 | 192 | 96 | 30 | |
12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl de PM12 +10µM de taxol a RT. | |
1600 | 800 | 400 | 100 | µl de MTs de 2,0mg/ml en PM12 más 20uM de taxol. | |
30 | 15 | 7 | 1,8 | µl de 100 mM de ATP. | |
24 | 12 | 6 | 1,5 | µl de 2.5M de azida sódica | |
400 | 200 | 100 | 25 | µl de DN01 1mg/ml. |