Kuva 2. CS-DN01:n mikrotubuluksen aktivoima ATPaasiaktiivisuus käyttäen Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit -määrityssarjaa (Cat. # BK053). CS-DN01-ATPaasi määritettiin kahtena kappaleena kuvatun menetelmän mukaisesti. Kontrollireaktioita ilman mikrotubuluksia verrattiin niihin, joissa oli mikrotubuluksia. 4 mM natriumatsidia inhiboi pääasiassa kinesiiniaktiivisuutta, kun taas 30 µM natriumvanadaattia inhiboi dyneiiniä.
1. Noudata protokollaa MT-liuoksen valmistamiseksi 2,0 mg/ml:n pitoisuudessa PEM-puskurissa, johon on lisätty peräkkäin taksolia. 1 mg riittää 96 määritykseen.
a) Resuspensio 1 mg >99 % puhdasta sian tubuliinia (Cat. # T240) 0,5 ml:ssa jääkylmää PEM:ää + 10 % glyserolia (ylimääräisen GTP:n lisääminen ei ole tarpeen).
b) Asetetaan 37 °C:seen 2 minuutiksi.
c) Lisätään 1 µl 2 mM verrokkia (loppukonsentraatio = 4 µM), inkuboidaan vielä 2 minuuttia.
d) Lisää 1 µl 2 mM taksolia (lopullinen konsentraatio = 4+4 µM), inkuboi vielä 2 min.
e) Lisää 3 µl 2 mM taksolia (lopullinen konsentraatio = 4+4+12 µM), inkuboi vielä 2 min.
f) Laita penkkiin (ei jäähylle eikä 4°C:een) ja taksolilla stabiloidut MT:t ovat nyt valmiita. Säilyvyysaika on 3 vrk, jos ei ole kontaminoitunut ötököillä tai muilla kemikaaleilla.
Huomautus: Seulontatarkoituksiin MT:t valmistetaan ja käytetään samana päivänä, älkää käyttäkö, jos ne ovat yli 6 h vanhoja, koska jatkuvan hydrolyysin vuoksi fosfaattia kertyy. Tämä lisää taustaa ja heikentää S/N-suhdetta.
2. Valmistetaan yhdisteet 20X 100 %:n DMSO-liuoksessa.
Suosittelemme 10 µl kantaliuosta 2 mM:n yhdisteellä.
3. Valmistetaan moottoriseos seuraavasti.
a) b) Valmistetaan 10 ml PM12-puskuria, jossa on 10 µM:n taksoli loppuosa (50 µl:aa 2 mM:n taksoli-kantaliuosta). Tarkista reaktiopuskuri saostuman varalta, tee uusi liuos, jos saostumaa esiintyy.
c) Sulata 100 µg:n injektiopullo DN01:tä asettamalla se huoneenlämpöiseen vesihauteeseen, kunnes se on sulanut, ja aseta se sitten jäälle.
d) Sekoita seuraavat aineet järjestyksessä huoneenlämmössä (RT) 20 ml:n polypropyleenipullossa (ei lasi):
| # of assays | 384 | 192 | 96 | 30 | |
| 12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl PM12 +10µM taxolia RT:ssä. | |
| 1600 | 800 | 400 | 100 | µl 2.0mg/ml MT:tä PM12:ssa plus 20uM taxolia. | |
| 30 | 15 | 7 | 1.8 | µl 100 mM ATP:tä. | |
| 24 | 12 | 6 | 1.5 | µl 2.5M natriumatsidia | |
| 400 | 200 | 100 | 25 | µl DN01 1mg/ml. |