Cytoplazmatikus dynein motorfehérje

2. ábra. CS-DN01 mikrotubulus aktivált ATPáz aktivitás a Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit (Cat. # BK053) segítségével. A CS-DN01 ATP-ázt két példányban vizsgáltuk a leírt módszer szerint. A mikrotubulusok nélküli kontrollreakciókat a mikrotubulusokat tartalmazó reakciókkal hasonlítottuk össze. A 4 mM nátrium-azid elsősorban a kinein aktivitást gátolja, míg a 30 µM nátrium-vanadát a dyneint.

1. Kövesse a protokollt, hogy 2,0 mg/ml MT oldatot készítsen PEM pufferben plusz szekvenciálisan hozzáadott taxolban. 1 mg elegendő 96 vizsgálathoz.

a) Reszuszpendáljunk 1 mg >99%-os tisztaságú sertés tubulint (Cat. # T240) 0,5 ml jéghideg PEM + 10% glicerinben (extra GTP hozzáadása nem szükséges).

b) Tegyük 37°C-ra 2 percre.

c) Adjunk hozzá 1 µl 2 mM taxolt (végső koncentráció = 4 µM), inkubáljuk további 2 percig.

d) Adjunk hozzá 1 µl 2 mM taxolt (végső koncentráció = 4+4 µM), inkubáljuk további 2 percig.

e) Adjunk hozzá 3 µl 2 mM taxolt (végső koncentráció = 4+4+12 µM), inkubáljuk további 2 percig.

f) Helyezzük a padra (nem jégen vagy 4°C-on), és a taxollal stabilizált MT-k már készen vannak. Az eltarthatósági idő 3 nap, ha nem szennyezett bogarakkal vagy más vegyszerekkel.

Megjegyzés: Szűrési célokra az MT-ket még aznap elkészítjük és felhasználjuk, ne használjuk, ha 6 óránál idősebbek, mert a folyamatos hidrolízis miatt foszfát képződik. Ez növeli a hátteret és csökkenti az S/N arányt.

2. Készítse elő a vegyületeket 20X 100 %-os DMSO oldatban.

10 µl törzsoldat 2 mM vegyületnél ajánlott.

3. Készítse el a motorkeveréket az alábbiak szerint.

a) b) Készítsen 10 ml PM12 puffert 10 µM taxol végleges (50 µl 2 mM taxol törzs). Ellenőrizze a reakciópuffert csapadékképződés szempontjából, készítsen új oldatot, ha csapadék jelen van.

c) Olvasszon fel 100 µg DN01 fiolát úgy, hogy szobahőmérsékletű vízfürdőbe helyezi, amíg fel nem olvad, majd jégre helyezi.

d) 20 ml-es polipropilén (nem üveg) fiolában szobahőmérsékleten (RT) keverjük össze a következőket sorrendben:

.