Figura 2. CS-DN01 attività ATPasi attivata dal microtubulo usando il Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit (Cat. # BK053). CS-DN01 ATPasi è stato valutato in duplicato secondo il metodo descritto. Le reazioni di controllo senza microtubuli sono state confrontate con quelle con microtubuli. 4 mM sodio azide inibisce principalmente l’attività della chinesina, mentre 30 µM sodio vanadato inibisce la dineina.
1. Seguire il protocollo per preparare la soluzione di MT a 2,0 mg/ml nel PEM Buffer più taxolo aggiunto in sequenza. 1 mg è sufficiente per 96 saggi.
a) Risospendere 1 mg di tubulina suina pura al >99% (Cat. # T240) in 0,5 ml di PEM freddo come il ghiaccio + 10% glicerolo (l’aggiunta di ulteriore GTP non è necessaria).
b) Mettere a 37°C per 2 minuti.
c) Aggiungere 1 µl di taxolo 2 mM (conc finale = 4 µM), incubare per altri 2 minuti.
d) Aggiungere 1 µl di taxolo 2 mM (conc finale = 4+4 µM), incubare per altri 2 min.
e) Aggiungere 3 µl di taxolo 2 mM (conc finale = 4+4+12 µM), incubare per altri 2 min.
f) Mettere sul banco (non su ghiaccio o a 4°C) e le MT stabilizzate con taxolo sono pronte. La durata di conservazione è di 3 giorni se non contaminata da insetti o altre sostanze chimiche.
Nota: Per scopi di screening, le MT sono fatte e usate lo stesso giorno, non usarle se hanno più di 6 ore perché il fosfato si accumulerà a causa della continua idrolisi. Questo si aggiungerà allo sfondo e ridurrà il rapporto S/N.
2. Preparare i composti a 20X in soluzione 100% DMSO.
Si raccomandano 10 µl di soluzione stock a 2 mM di composto.
3. Preparare la miscela del motore come segue.
a) b) Preparare 10 ml di tampone PM12 con 10 µM di taxolo finale (50 µl di 2 mM di taxolo stock). Controllare la presenza di precipitato nel tampone di reazione, preparare una nuova soluzione in caso di precipitazione.
c) Scongelare la fiala da 100 µg di DN01 mettendola in un bagno d’acqua a temperatura ambiente fino allo scioglimento, quindi metterla in ghiaccio.
d) Mescolare i seguenti elementi nell’ordine a temperatura ambiente (RT) in una fiala di polipropilene da 20 ml (non di vetro):
| # di saggi | 384 | 192 | 96 | 30 | |
| 12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl di PM12 +10µM taxolo a RT. | |
| 1600 | 800 | 400 | 100 | µl di 2.0mg/ml MTs in PM12 più 20uM taxolo. | |
| 30 | 15 | 7 | 1.8 | µl di 100 mM ATP. | |
| 24 | 12 | 6 | 1.5 | µl di 2.5M sodio azide | |
| 400 | 200 | 100 | 25 | µl di DN01 1mg/ml. |