Figura 2. Aktywność ATPazy aktywowanej mikrotubulami CS-DN01 przy użyciu Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit (Cat. # BK053). ATPazę CS-DN01 oznaczano w duplikatach zgodnie z opisaną metodą. Reakcje kontrolne bez mikrotubul porównano z tymi z mikrotubulami. 4 mM azydek sodu hamuje głównie aktywność kinezyny, podczas gdy 30 µM wanadan sodu hamuje aktywność dyneiny.
1. Postępować zgodnie z protokołem w celu przygotowania roztworu MT o stężeniu 2,0 mg/ml w buforze PEM plus sekwencyjnie dodawany taksol. 1 mg wystarcza na 96 testów.
a) Zawiesić 1 mg >99% czystej tubuliny świńskiej (nr kat. T240) w 0,5 ml lodowato zimnego PEM + 10% glicerolu (dodanie dodatkowego GTP nie jest konieczne).
b) Umieścić w temperaturze 37°C na 2 minuty.
c) Dodać 1 µl 2 mM taksolu (stężenie końcowe = 4 µM), inkubować przez kolejne 2 minuty.
d) Dodać 1 µl 2 mM taksolu (końcowe stężenie = 4+4 µM), inkubować przez kolejne 2 minuty.
e) Dodać 3 µl 2 mM taksolu (końcowe stężenie = 4+4+12 µM), inkubować przez kolejne 2 minuty.
f) Umieścić na stole laboratoryjnym (nie na lodzie ani w temperaturze 4°C) i MT stabilizowane taksolem są gotowe. Okres przechowywania wynosi 3 dni, jeśli nie są zanieczyszczone robakami lub innymi chemikaliami.
Uwaga: Do celów przesiewowych, MTs są wykonywane i używane tego samego dnia, nie należy ich używać, jeśli mają więcej niż 6 godzin, ponieważ fosforan będzie się gromadził z powodu ciągłej hydrolizy. Spowoduje to zwiększenie tła i zmniejszy stosunek S/N.
2. Przygotować związki w stężeniu 20X w 100% roztworze DMSO.
Zaleca się 10 µl roztworu podstawowego w stężeniu 2 mM związku.
3. Przygotować mieszankę motoryczną w następujący sposób.
a) b) Przygotować 10 ml buforu PM12 z 10 µM taksolu (50 µl roztworu podstawowego 2 mM taksolu). Sprawdzić bufor reakcyjny pod kątem wytrącania się osadu, sporządzić nowy roztwór, jeżeli wytrącanie jest obecne.
c) Rozmrozić fiolkę 100 µg DN01 umieszczając ją w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej aż do stopienia, następnie umieścić na lodzie.
d) Wymieszać następujące składniki w kolejności w temperaturze pokojowej (RT) w fiolce polipropylenowej o pojemności 20 ml (nie szklanej):
| # assays | 384 | 192 | 96 | 30 | |
| 12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl PM12 +10µM taxolu w RT. | |
| 1600 | 800 | 400 | 100 | µl 2,0mg/ml MTs w PM12 plus 20uM taksolu. | |
| 30 | 15 | 7 | 1,8 | µl 100 mM ATP. | |
| 24 | 12 | 6 | 1.5 | µl 2.5M azydku sodu | |
| 400 | 200 | 100 | 25 | µl preparatu DN01 1mg/ml. |
.