Figure 2. CS-DN01 atividade ATPase ativada por microtubo usando o Kinesin ATPase Endpoint Assay Kit (Cat. # BK053). O CS-DN01 ATPase foi testado em duplicado de acordo com o método descrito. As reacções de controlo sem microtubos foram comparadas com as reacções com microtubos. A azida sódica 4 mM inibe principalmente a actividade da cinina, enquanto que o vanadate sódico 30 µM inibe a dynein.
1. Seguir protocolo para preparar solução MT a 2,0 mg/ml em PEM Buffer mais taxol adicionado sequencialmente. 1 mg é suficiente para 96 ensaios.
a) Ressuspender 1 mg >99% de tubulina suína pura (Cat. # T240) em 0,5 ml de PEM frio + 10% de glicerol (não é necessário adicionar GTP extra).
b) Colocar a 37°C durante 2 min.
c) Adicionar 1 µl de taxol 2 mM (conc final = 4 µM), incubar durante mais 2 min.
d) Adicionar 1 µl de taxol 2 mM (conc final = 4+4 µM), incubar durante mais 2 min.
e) Adicionar 3 µl de taxol 2 mM (conc final = 4+4+12 µM), incubar durante mais 2 min.
f) Colocar sobre a bancada (não sobre gelo ou a 4°C) e as MT estabilizadas com taxol estão agora prontas. A vida útil é de 3 dias se não estiver contaminada com insectos ou outros químicos.
Nota: Para fins de triagem, as MTs são feitas e utilizadas no mesmo dia, não utilizar se tiverem mais de 6 h de idade porque o fosfato se acumulará devido à hidrólise contínua. Isto irá adicionar ao fundo e reduzir a razão S/N.
2. Preparar compostos a 20X em solução 100% DMSO.
10 µl de solução de reserva a 2 mM composto é recomendado.
3. Preparar mistura motora como se segue.
a) b) Preparar 10 ml de tampão PM12 com 10 µM de taxol final (50 µl de reserva de taxol 2 mM). Verificar a precipitação do tampão de reacção, fazer uma nova solução se a precipitação estiver presente.
c) Descongelar o frasco de 100 µg de DN01, colocando num banho de água à temperatura ambiente até à sua fusão, e depois colocar sobre gelo.
d) Misturar o seguinte, por ordem à temperatura ambiente (RT), num frasco de 20 ml de polipropileno (não vidro):
| # de ensaios | 384 | 192 | 96 | 30 | |
| 12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl de PM12 +10µM taxol no RT. | |
| 1600 | 800 | 400 | 100 | µl de 2,0mg/ml de MTs em PM12 mais 20uM de taxol. | |
| 30 | 15 | 7 | 1.8 | µl de 100 mM ATP. | |
| 24 | 12 | 6 | 1.5 | µl de 2.5M azida sódica | |
| 400 | 200 | 100 | 25 | µl de DN01 1mg/ml. |