Abbildung 2. CS-DN01 Mikrotubuli-aktivierte ATPase-Aktivität unter Verwendung des Kinesin ATPase Endpoint Assay Kits (Kat. # BK053). Die CS-DN01-ATPase wurde nach der beschriebenen Methode in zweifacher Ausführung getestet. Kontrollreaktionen ohne Mikrotubuli wurden mit denen mit Mikrotubuli verglichen. 4 mM Natriumazid hemmt hauptsächlich die Kinesin-Aktivität, während 30 µM Natriumvanadat das Dynein hemmt.
1. Befolgen Sie das Protokoll zur Herstellung einer MT-Lösung mit 2,0 mg/ml in PEM-Puffer plus sequentiell zugegebenem Taxol. 1 mg reicht für 96 Assays.
a) 1 mg >99% reines Schweinetubulin (Kat.-Nr. T240) in 0,5 ml eiskaltem PEM + 10% Glycerin resuspendieren (die Zugabe von zusätzlichem GTP ist nicht erforderlich).
b) 2 Minuten bei 37°C inkubieren.
c) 1 µl 2 mM Taxol (Endkonzentration = 4 µM) zugeben, weitere 2 Minuten inkubieren.
d) 1 µl 2 mM Taxol (Endkonzentration = 4+4 µM) zugeben, weitere 2 Minuten inkubieren.
e) 3 µl 2 mM Taxol (Endkonzentration = 4+4+12 µM) zugeben, weitere 2 Minuten inkubieren.
f) Auf den Labortisch stellen (nicht auf Eis oder bei 4°C) und die Taxol-stabilisierten MTs sind nun fertig. Die Haltbarkeit beträgt 3 Tage, wenn sie nicht mit Ungeziefer oder anderen Chemikalien verunreinigt sind.
Hinweis: Für Screening-Zwecke werden die MTs am selben Tag hergestellt und verwendet; sie dürfen nicht verwendet werden, wenn sie älter als 6 Stunden sind, da sich durch die fortgesetzte Hydrolyse Phosphat bildet. Dies führt zu einer Erhöhung des Hintergrunds und einer Verringerung des S/N-Verhältnisses.
2. Bereiten Sie die Verbindungen in 20-facher Konzentration in 100%iger DMSO-Lösung vor.
Empfohlen werden 10 µl Stammlösung mit 2 mM Verbindung.
3. Bereiten Sie die Motormischung wie folgt vor.
a) b) Bereiten Sie 10 ml PM12-Puffer mit 10 µM Taxol-Endlösung (50 µl 2 mM Taxol-Stamm) vor. Überprüfen Sie den Reaktionspuffer auf Ausfällungen und stellen Sie eine neue Lösung her, falls eine Ausfällung vorhanden ist.
c) Tauen Sie das Fläschchen mit 100 µg DN01 auf, indem Sie es in ein Wasserbad mit Raumtemperatur stellen, bis es geschmolzen ist, und dann auf Eis legen.
d) Mischen Sie bei Raumtemperatur (RT) in einem 20-ml-Polypropylenfläschchen (nicht aus Glas) nacheinander Folgendes:
| Anzahl der Assays | 384 | 192 | 96 | 30 | |
| 12800 | 6400 | 3200 | 800 | µl von PM12 +10µM Taxol bei RT. | |
| 1600 | 800 | 400 | 100 | µl von 2,0mg/ml MTs in PM12 plus 20uM Taxol. | |
| 30 | 15 | 7 | 1,8 | µl 100 mM ATP. | |
| 24 | 12 | 6 | 1,5 | µl von 2.5M Natriumazid | |
| 400 | 200 | 100 | 25 | µl DN01 1mg/ml. |